柱式PCR产物纯化试剂盒

产品货号：

GS0050

中文名称：

柱式PCR产物纯化试剂盒

英文名称：

SgPrep Column PCR Product Purification Kit

产品规格：

50次|100次

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本试剂盒适用于从PCR反应液或各种酶促反应液中纯化回收DNA片段。本试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTPs等，得到高质量的DNA纯化产物，可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学实验。

适用范围广，回收效率高，对于100bp～10kb之间的DNA片段回收效率在90%以上。
操作简单快速，整个回收过程仅需5min左右。
洗脱效率高，洗脱体积最小可低至15μL。

组分	50次	100次
结合液BB3	24mL	48mL
洗涤液WB	12mL	24mL
洗脱液EB	5mL	10mL
吸附柱及收集管	50套	100套

保存：室温干燥

结合液BB3中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

快速流程

准备工作
□ 检查洗涤液WB中是否已加入无水乙醇。
□ 检查结合液BB3中是否已加入异丙醇。
□ 检查结合液BB3是否出现沉淀。
在PCR反应液中加入5倍体积的结合液BB3，充分混匀。
8000g离心30秒。倒掉收集管中液体。
加入500μL洗涤液WB，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体。
重复步骤4一次。
空柱于9000g离心1分钟。
将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15～40μL洗脱液EB，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。

准备工作：

自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力),12000g)、1.5mL离心管、无水乙醇、异丙醇等。
按瓶身标签说明在洗涤液WB中加入相应噩的无水乙醇（乙醇终浓度为80%)，混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。
按瓶身标签说明在结合液BB3中加入相应量的异丙醇（异丙醇终浓度为20%)，混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。
结合液BB3在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

操作步骤：

将PCR反应液或酶促反应液移至—干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的结合液BB3，充分混匀。
- 首次使用前请先检查是否已加入适量的异丙醇。
- 若反应液体积过小，可用TE或水补足至100μL，然后再加入500μL结合液BB3。
将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同—个收集管中。
- 如果体系总体积大于750μL，则每次使用750μL，多次上柱。
- 将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱，可以进—步提高DNA回收率。
向吸附柱中加入500μL洗涤液WB，9000g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同—个收集管中。
- 洗涤液WB首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇。
重复步骤3一次。
将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。
- 此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
在吸附膜中央加入15～40μL洗脱液EB，室温静置1～2min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。
- 洗脱液EB为2.5mM Tris-HCl，pHB.5，可以用TE或水(pH＞7.0)代替。
- 洗脱液EB预热至60℃可以进—步提高得率。
- 如果片段＞4kb，在37～60℃温浴2分钟可以显著提高得率。
- 请勿使用小于15μL的洗脱液进行洗脱。

PCR产物回收效率较低或者未回收到目的片段
- 洗涤液WB中未加入正确量的无水乙醇。
- 提高结合液BB3的相对浓度，增加DNA与吸附膜的作用时间（静置时间），在—定程度上可以提高回收率。
- 如果纯化的片段长度大于4kb或者目的片段含量较少，可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱，以提高回收效率。
- 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大的洗脱效率。
- 洗脱液不合适：洗脱缓冲液的pH值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其pH值＞7.0，pH值过低可能导致低洗脱效率。
- 洗脱时将洗脱液预热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
- 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也有影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。
回收的PCR产物进行后续酶切或者连接效率低
- 若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干2～5分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。
- 盐份的残留。请确保使用洗涤液WB冲洗两次，每次500μL沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。
- 回收后的PCR产物在反复冻融的情况下，会加速末端A和整个PCR产物的断裂，从而造成与T载体连接或直接酶切效率的下降。建议回收后立即进行酶切或连接实验。
- 选择合适的PCR产物和T载体的分子数比例，有助于提高连接效率。
- 请确保PCR最后72℃ 5～10分钟的延伸时间，这样才有足够的PCR产物在末段带有A附加碱基，保证较高的连接效率。
回收的片段为什么电泳上样会漂起来？
- 主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥2～5分钟，有助于残留的乙醇挥发完全。

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